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目前，新冠疫情仍在全球蔓延，并导致超过650万例感染死亡病例。以Beta、Gamma、Delta和Omicron为代表的SARS-CoV-2变异株频繁出现，或因更强的传播性、致病性和免疫逃避能力，使得疫苗接种等预防措施难以阻断COVID-19大流行病的持续爆发。因此，迫切需要开发高效的能够快速识别病毒变种的方法及相关器件。相比传统的RT-qPCR 等检测方法，基于二维（2D）材料的场效应晶体管（FET）生物传感器因其超高灵敏、快速实时等优点，受到了广泛关注。然而，如何进一步提高晶体管传感器的精确感知能力，使其能够识别核酸分子内部关键信息、特别是单碱基变异，是实现新冠病毒变异株分型的关键。
近日，南京理工大学曾海波&陈翔教授团队探索和研究了二维硒化铟（2D InSe）FET对SARS-CoV-2变异核酸序列的识别能力。首先，原子层沉积（ALD）氧化铝保证了2D InSe FET的迁移率和稳定性，使器件对目标核酸实现了亚飞摩尔级（sub-fM）的检测限，浓度线性响应范围达到6个数量级（10-14~10-8 M）。其次，器件可以在15分钟内识别出单核苷酸变异（SNVs）的类型与位置（p < 0.01），从而直接快速分辨出Delta基因组中的两个核心突变（L452R, R203M）。该性能主要归功于沉积氧化铝后，2D InSe发生了浅层氧取代（InSe1-xOx）。后者在2D InSe中引入的陷阱态（Traps）对核酸负电荷信号敏感并参与载流子输运，引起2D InSe FET超灵敏的电信号变化。该研究实现了病毒检测、变异诊断与预警的一体式传感，对后疫情时代各类高传染、易突变病毒的早期筛查具有重要的意义。
采用机械剥离，从块体InSe单晶中获得厚度为6~10 nm的2D InSe纳米片，以作为场效应晶体管的沟道材料。在制作源/漏电极前后，Al2O3分两次沉积到2D InSe表面，之后旋涂PMMA保护器件。为实现2D InSe FET的传感功能，通过电子束曝光（EBL）去除沟道上的PMMA，使得沟道上方可以正常进行探针孵育和核酸检测。稳定性测试表明，Al2O3层有效提高了FET器件在磷酸盐缓冲盐水（0.01× PBS）中的稳定性。在PBS中浸泡48 h后，FET器件的开态电流仍高达初始电流值的73.5%，迁移率也无明显下降（> 10 cm2·V-1·s-1），完全满足探针固定（36 h）和在PBS中传感的器件稳定性要求。
当通过该FET检测核酸时，核酸的磷酸盐骨架会在缓冲盐水中发生电离从而表现为负电荷。目标核酸被FET表面的探针捕获后，会在沟道上形成等效负栅极电压。这导致n型InSe半导体的费米能级（EF）向下移动，降低了电子的迁移率和密度，从而使得源/漏电流降低。为了更好的反映核酸形成的等效负栅极电压，我们定义了器件的校准响应为：
实验结果表明，10~15分钟后，2D InSe FET的对核酸的响应趋于稳定，且具有较宽的线性工作范围（10-14~10-8 M）。根据拟合结果，2D InSe FET对DNA和RNA的检测极限分别为0.71 fM和0.79 fM。同时，开尔文探针力显微镜（KPFM）的表征也证明，DNA和RNA可以在沟道上方形成不同的等效负电势，分别为-154 mV和-111 mV。
图1. 二维InSe晶体管用于快速超灵敏检测SARS-CoV-2。2D InSe FET结构示意图(A)和实物光镜图像(B)。(C) 2D InSe FET稳定性试验（PBS溶液中）。(D) PBS中器件的开态电流（归一化）和迁移率随时间变化。2D InSe FET对目标DNA (E)和RNA (F)序列的浓度传感实验。(G,H) FET对互补核酸序列（未突变）的校准响应(∆Vcal)。(I)对不同浓度互补序列的线性响应范围。通过KPFM检测到的DNA (K)或RNA (L)杂交前后(J)的表面电位变化和对应的能带示意图。
多种碱基类型的单核苷酸突变在SARS-CoV-2变异株中很常见。例如，R203M和R203K分别是Delta和Gamma变异株的特征同位突变，它们具有不同的核苷酸错配类型，但位于相同的位置。此外，突变核苷酸的位置也是重要的信息。例如，在Delta、Beta和Gamma中都存在D614G突变，这意味着出现D614G的位置可以成为快速识别变异株的通用测序点。在这两方面，2D InSe FET表现出优异的识别能力。在40℃下，FET对C-C、C-T 和C-A三类不同碱基类型突变均有不同相应，且与互补序列显著区分。而通过调整工作温度，FET可以在60℃下实现对不同突变位置序列的区分，空间分辨率约为七个碱基间隔。2D InSe FET的响应与高分辨熔解曲线（HRM）高度吻合，后者可以独立分析核酸序列在溶液体系的稳定状态，用于验证2D InSe FET响应的可靠性。基于对突变碱基类型和位置的良好分辨率，2D InSe FET可实现对Delta关键突变：R203M（N）和L452R（S）快速识别（单因素方差分析：†††p < .001）。
图2. 利用2D InSe FET直接识别SARS-CoV-2 单核苷酸突变（SNVs）。(A) 不同SARS-CoV-2变异株对应的高频突变示意图。(B) FET对DNA上同一位置、不同类型的单碱基对突变的时间依赖性响应（ORF1ab区域）。(C) 不同碱基突变类型ORF1ab序列的HRM分析。(D) 比较FET的平均校准响应和熔解温度Tm，用于验证识别不同碱基类型突变的可行性。(E) 不同单碱基突变位置的HRM分析。(F) HRM中定义的熔解温度Td显示第21位、第13位和第6位突变的核酸序列显著不同。(G) FET对不同突变位置核酸的平均校准响应与HRM分析结果高度一致。(H) 对两种Delta关键突变：R203M（N）和L452R（S）的HRM分析。(I) 60℃下对R203M突变的FET校准响应。(J) 40℃下对L452R突变的FET校准响应。
经过两步ALD工艺，在2D InSe FET上构建了一层Al2O3薄膜作为保护层。拉曼光谱显示ALD后的InSe在309 cm-1处增加了对应于In-O振动的Ag模式，表明了InSe1-xOx的形成。x射线光电子能谱（XPS）的结果为InSe1-xOx的存在，提供了另一个有力的证据。在Se 3d和In 3d结合能剖面上，可以明显观察到峰的展宽和偏移，这主要是由于电子从未氧化层（InSe）转移到氧取代层（InSe1-xOx）。为了验证InSe氧化的影响以及随后传感能力的提高，本研究在DFT框架下计算原始2D InSe和2D InSe1-xOx的能带结构和态密度（DOS）。由于O原子对In原子p轨道的影响，In-p主导的InSe导带发生了明显的变化，具体表现为带隙变窄（1.52 → 0.36 eV）和从间接带隙向直接带隙转变。在O原子取代后，DOS曲线显示了InSe1-xOx在InSe的导带和价带之间形成的局域态，其中对应的能级作为捕获载流子的陷阱态。
图3. 二维InSe晶体管的突变识别机制。(A) 原始2D InSe和ALD-Al2O3工艺后的InSe原位光镜图像。(B)原始InSe和InSe1-xOx（ALD后）的拉曼光谱。(C)原始InSe和InSe1-xOx的XPS能谱。(D) 具有六方结构和D3h对称性的InSe晶体以及晶胞中Se空位发生O取代的InSe1-xOx。(E,F) InSe和InSe1-xOx的能带结构。(G) 原始2D InSe和InSe1-xOx的DOS模拟结果。(H) InSe1-xOx中陷阱态诱导的载流子输运的示意图。
当栅极电压偏置为正时，根据多陷阱捕获和释放（MTR）模型，电子可以占据局域态之间的浅陷阱态。根据热力学阿伦尼乌斯（Arrhenius）模型和变程跳跃（VRH）模型，填充在陷阱态的电子跳跃输运行为占主导地位。因此，在2D InSe FET 生物传感器中，需要给出如下陷阱态载流子浓度的变化（Δnt）的公式，以分析陷阱态的作用：
其中，n0为导带平衡载流子浓度，Nc为导带有效态密度，Nt为陷阱态密度，Et为陷阱态能级，k0为玻尔兹曼常数，T为温度。当目标核酸产生的负表面电位导致InSe费米能级出现一个微小的向下偏移时：ΔEF ≪ Ec-EF，此时n0可以看成是一个常数。即在带传输机制下，核苷酸突变的变化太微弱而难以影响沟道的载流子输运。然而随着陷阱态的参与，在式（2）中ΔEF 的值相对Et-EF是不可忽略的，因为Et 能级的位置远比Ec更接近EF。因此负电势可以有效的限制电子填充陷阱，抑制电子跳跃传输。最终通过式（1）进一步放大这种填充抑制的效果，引起更多的电流下降，即实现了传感信号的增强。
综上所述，本文开发了一种支持直接快速识别SARS-CoV-2变异株的2D InSe FET，通过两步ALD过程保证了器件良好的稳定性和灵敏度。该FET生物传感器具有较宽的浓度检测范围（10-14~10-8 M），对DNA （0.71 fM）和RNA （0.79 fM）均具有超低的检测限。此外，该设备具有识别SARS-CoV-2单核苷酸突变的的关键能力（ORF1ab），包括在三个独立位置的不同碱基突变类型（p < 0.05）。根据校准响应的显著差异，该器件可以直接识别出Delta变异株的两个核心突变（L452R和R203M）。其中陷阱态在核酸传感中起积极作用，提高了载流子传输对核酸等效负电势的敏感度。该2D InSe FET为SARS-CoV-2 变异株的早期筛查、诊断和及时数据采集提供了一种新策略，有望对病毒的隐性传播进行有效预警，以指导公共卫生干预措施。
